先要配制孢子形成培養(yǎng)基。孢子形成培養(yǎng)基時由硝酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸美、氯化鉀及硫酸亞鐵及糖類的全部或一部分配制的，PH為4～7，優(yōu)選為5～6.5。在此配制培養(yǎng)基中加入瓊脂，經(jīng)加熱滅菌后冷卻凝固，把其產(chǎn)物作為孢子形成培養(yǎng)基。只要能使菌絲增殖和孢子形成，對孢子形成培養(yǎng)基無特別要求，其特征為把PH調(diào)至適合孢子形成的4～7范圍內(nèi)。
具體舉例，如在Czapek瓊脂培養(yǎng)基(硝酸鈉2g/L、磷酸氫二鉀1g/L、硫酸美·7結(jié)晶水0.5g/L、氯化鉀0.5g/L、硫酸亞鐵·7結(jié)晶水0.01g/L、蔗糖30g/L、瓊脂13g/L)中加入鹽酸或硫酸，將PH調(diào)至6.0的培養(yǎng)基。再舉一例，如在Czapek-Dox瓊脂培養(yǎng)基(硝酸鈉2g/L、磷酸氫二鉀1g/L、硫酸美·7結(jié)晶水0.5g/L、氯化鉀0.5g/L、硫酸亞鐵·7結(jié)晶水0.01g/L、葡萄糖30g/L、瓊脂13g/L)中加入鹽酸或硫酸，將PH調(diào)至6.0的培養(yǎng)基。
用此方法在試管內(nèi)制成斜面培養(yǎng)基(Slant培養(yǎng)基)或在培養(yǎng)皿內(nèi)制成平板培養(yǎng)基(Plate培養(yǎng)基)，在此培養(yǎng)基上接種菌絲或孢子，在好氣條件下進行固體培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度保持在0～40℃，優(yōu)選10～35℃，更優(yōu)選在15～30℃使其增殖和孢子形成。培養(yǎng)溫度可在中途改變，例如可使其在25℃條件下增殖后，在5℃條件下培養(yǎng)。
確認孢子形成后，在固體培養(yǎng)菌絲中添加滅菌水，用常用方法攪拌獲得孢子懸浮液。添加于滅菌水中的添加物無特別要求，可為純水，亦可添加表面活性劑、無機鹽類等，還可使用預(yù)先調(diào)制的生理鹽水。攪拌方法可從外部給固體培養(yǎng)容器加力，亦可使用預(yù)先滅菌的刷子等直接攪拌菌絲。
將上述得到的孢子懸浮液或?qū)㈡咦雍途z的懸浮液作為保藏原液。此保藏原液可用滅菌水或表面活性劑或含有無機鹽類的水溶液稀釋后再重新作為保藏原液。之后在此保藏原液中添加冷凍保護劑。對冷凍保護劑的使用一般無特別要求，可從瓊脂粉、牛血清、DMSO、甘油、肌醇、聚乙烯醇、脫脂牛奶等中選一種或多種添加。具體舉例，如為使保藏液中甘油濃度達到10％，可把甘油作為冷凍保護劑添加。
添加冷凍保護劑后，將保藏液分裝在保藏容器中。容器宜使用滅菌塑料凍存管等，具體舉例，如把保藏液在無菌操作條件下分裝于容量1.2mL的凍存管中等。之后將此保藏容器置于超低溫冰箱內(nèi)保藏。超低溫冰箱內(nèi)的溫度需控制在-100℃～-20℃范圍內(nèi)，優(yōu)選在-90℃～-30℃，更優(yōu)選在-85℃～-50℃。
由此，在超低溫冰箱內(nèi)保藏的菌株可長時間、穩(wěn)定地保藏。 |
